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品牌 | Biosharp | |
基础属性 | 生产企业 | |
cas号 | ||
规格 | 5X1ml | |
储存条件 | ||
纯度 | ||
密度 |
下单前联系销售
SYBR Green Master Mix
荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green)
产品编号 |
产品名称 |
规格 |
BL705A |
荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green) |
5X1mL |
别名:SYBR Green荧光定量PCR预混液
产品简介:
本产品是使用SYBR® Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用预混液。核心组分为一种新型的抗体法热启动DNA聚合酶,具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点,配以针对qPCR优化的最适Buffer,非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应。本产品是一种含有qPCR反应最适浓度SYBR® Green I的2×预混液,可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对靶基因定量准确、重复性好、可信度高。同时,优化的预混液可缩短Real-Time PCR的反应时间,适用于标准或快速PCR仪。
产品组分:
产品编号 |
产品名称 |
规格 |
1 |
2×qPCR MasterMix (SYBR Green) |
5×1mL |
2 |
50×ROX Reference Dye |
1ml |
3 |
RNase-Free ddH2O |
5ml |
保存条件:
收到本产品后, 请立即置于-20 ℃ 避光保存。从-20 ℃ 取出使用时, 将冻存的qPCR MasterMix和ROX Reference Dye融解,然后轻轻颠倒混匀,待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用,须彻底混匀后重新冷冻。(在解冻过程中盐会出现分层现象,如未混匀进行冷冻,盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用,可在2~8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。
使用说明:
一、配制 Real-Time PCR反应体系:
1.、将所有试剂qPCR MasterMix,ROX Reference Dye,模板,引物和RNase-Free ddH2O,在室温下溶解并彻底混匀。
2、建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。
参考下表配制反应体系:
组分 |
20ul体系 |
25ul体系 |
50ul体系 |
终浓度 |
qPCR MasterMix |
10μl |
12.5 μl |
25 μl |
1× |
正向引物(10 μM) |
0.6 μl |
0.75 μl |
1.5 μl |
300 nM* |
反向引物(10 μM) |
0.6 μl |
0.75 μl |
1.5 μl |
300 nM* |
cDNA模板 |
- |
- |
- |
-- |
ROX Reference Dye |
- |
- |
- |
- |
RNase-Free ddH2O |
至20 μl |
至25 μl |
至50 μl |
- |
* 一般来说反应体系中引物终浓度为300 nM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时,可以在终浓度200-500 nM范围内调整引物浓度。
* 几种常见仪器的最适ROX Reference Dye浓度见下表:
仪器型号 |
使用浓度 |
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等 |
5× |
ABI 7500、7500 Fast; Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等 |
1× |
Roche,Bio-Rad,Eppendorf等品牌仪器 |
无需添加 |
3、盖上反应管,轻柔混匀。可瞬时离心,确保所有样品均在管底。
二、进行Real-Time PCR反应
建议采用两步法PCR反应程序进行反应。
若模板量较低等因素导致扩增效果不佳,可使用三步法程序进行PCR反应。
两步法反应程序:
步骤 |
温度 |
持续时间 |
循环数 |
预变性 |
95℃ |
1min |
1 |
变性 |
95℃ |
5sec |
40 |
退火延伸数据采集 |
60℃ |
15sec |
40 |
溶解曲线分析 |
根据仪器推荐程序设置 |
三步法反应程序:
步骤 |
温度 |
持续时间 |
循环数 |
预变性 |
95℃ |
1min |
1 |
变性 |
95℃ |
5sec |
40 |
退火 |
50-60℃ |
10sec |
40 |
延伸数据采集 |
72℃ |
15sec |
40 |
溶解曲线分析 |
根据仪器推荐程序设置 |
* 请先使用60℃ 15 sec进行扩增。如果需要进一步优化,可以尝试在56-66℃ 范围内进行。
* 使用不同型号仪器进行时间设定时,请按照仪器使用说明书要求进行实验操作,几种常见仪器的时间设定见下表:
使用ABI7500时请设定在32 sec。
使用ABI 7000和7300时请设定在31 sec。
使用ABI 7700/7900HT/7500 Fast,Roche,BioRad和Agilent等公司荧光定量PCR仪时请设定在15sec。
* 通常引物退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使PCR的特异性增加;如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度。
常见问题
1、无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体
原因 |
解决办法 |
DNA模板中存在抑制剂 |
重新纯化模板或降低模板使用量 |
Mg2+浓度不合适 |
使用qPCR MasterMix时,PCR反应体系中Mg2+的终浓度为2 mM。对有些扩增体系,可以将Mg2+终浓度提高到5 mM。进行Mg2+终浓度优化时,建议每次增加0.5 mM Mg2+浓度进行实验。 |
PCR 条件、引物序列或浓度不当 |
请确认引物未发生降解,引物浓度及PCR 条件,扩增不好时,通常先尝试降低退火温度,延长退火时间和提高引物浓度,有时也可以提高退火温度,增加延伸时间,降低升温速度。对于GC 含量高的模板,可以适当延长变性时间。如果还是扩增不好,请重新设计引物。
|
起始模板问题 |
检查起始模板的浓度,保存条件和质量。重新对模板进行线性梯度稀释,并用新稀释模板进行实验。增加起始模板使用量。 |
加样错误或试剂问题 |
检查试剂浓度和保存条件,包括所使用的引物和模板。重复进行实验。 |
2、NTC出现较高的荧光值
原因 |
解决办法 |
试剂污染 |
建议使用新试剂进行实验。 |
PCR反应液配制时发生污染 |
采取必要的防污染策略(如使用带滤芯的枪头)。 |
引物出现降解 |
可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况。 |
3、出现引物二聚体和(或)非特异扩增
原因 |
解决办法 |
Mg2+浓度不合适 |
使用qPCR MasterMix的反应体系含有Mg2+的终浓度为2 mM。对有些扩增体系,可以将Mg2+终浓度增加到5 mM。 建议每次增加0.5 mM Mg2+浓度进行优化。 |
PCR退火温度太低 |
建议每次增加2℃进行退火温度优化。 |
引物设计不合适 |
考虑重新设计引物序列。 |
PCR产物太长 |
荧光定量PCR产物长度最好在100-150 bp之间,而且不应该超过500 bp。 |
引物出现降解 |
可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况。 |
计量误差 |
反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。 |
4、定量值重现性差
原因 |
解决办法 |
仪器方面的故障 |
因为仪器的不适用,在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。 |
样品纯度不好 |
不纯的样品会导致实验的重现性差。 |
稀释的模板放置太久 |
通过梯度稀释的模板最好现配现用。 |
引物质量下降 |
尽量避免新合成引物批次间的差异,可以使用原来质量好的引物做为对照。 |
PCR 反应条件、引物浓度、序列等不恰当 |
扩增效率差的PCR 较容易产生重现性差。通过变更引物的浓度或PCR 反应条件来进行调整。扩增不好时,一般可降低退火温度或提高引物浓度,也可以延长延伸时间。如模板的GC 含量较高,可延长变性时间。仍得不到改善时,建议重新设计引物。 |
计量误差 |
反应体积太小会导检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。 |
注意事项:
1、本产品中含有荧光染料SYBR Green I,保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
2、如果试剂没有混匀,其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀,请不要使用振荡器进行混匀,尽量避免出现泡沫,并经瞬时离心后使用。
3、引物纯度对反应特异性影响很大,建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
4、引物终浓度为0.3 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化,可以在 0.2-0.5 μM范围内调整引物浓度。
5、20 μl反应体系中,cDNA模板的使用量一般小于100 ng,基因组DNA模板量一般小于50 ng,逆转录产物作为模板时,使用量应不超过PCR体系终体积的20%。
6、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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