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货号H665664-10KU
品牌阿拉丁
品牌类型自有品牌(制造商)
货期40天
-+
品牌 | 阿拉丁 | |
基础属性 | 生产企业 | 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 |
cas号 | ||
规格 | 10KU | |
储存条件 | -20°C储存 | |
纯度 | 10000 U | |
密度 |
中文名:HiFi II M-MLV (H-) Reverse Transcriptase
英文名:HiFi II M-MLV (H-) Reverse Transcriptase
纯度:10000 U
货号:H665664-10KU
包装:10KU
存储温度:-20°C储存
产品介绍:
HiFi II M-MLV(H-)是经过突变的M-MLV基因利用大肠杆菌工程菌进行重组与表达的 逆转录酶,该酶能够催化以RNA或DNA:RNA杂交链为模板的互补DNA聚合反应。经 过突变的HiFi II M-MLV(H-)逆转录酶RNase H活性缺失,减少了逆转录反应中RNA的降 解,更容易获得全长的cDNA。HiFi II M-MLV(H-)逆转录酶能在55℃合成第一条链 cDNA,提供更高的特异性,稳定性强,可以合成最大12 kb的cDNA,cDNA产量高。 适用于第一链cDNA的合成、RT-PCR、RT-qPCR以及全长cDNA文库的构建等。
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活性定义:
以Poly(A)为模板,oligo(dT)为引物,在37℃条件下,10分钟内催化掺入1 nmol的dTTP所需酶量定义为一个活性单位(U)。
质量控制:
200 U的本酶和1 µg的16 S,23 S rRNA在37℃下反应1小时,RNA的电泳谱带不 发生变化。
注意事项:
1.在操作过程中应避免RNase污染,防止RNA降解或实验中的交叉污染,建议在专门 的区域进行RNA操作,使用专门的仪器和耗材,操作人员带口罩和一次性手套并经 常更换手套。
2.实验尽量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,应使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙 酯)水溶液在37℃处理12小时,并在120℃下高压灭菌30分钟后使用,或者将玻璃 器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC 处理后进行高压灭菌。
3.本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀,尽量避免起泡,并经短暂离心 后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃,避免反复冻融。
4.若起始RNA的量小于50 ng,建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供。
使用方法:
注意:10 ng-5 μg总RNA可建立20 μL反应体系,如果总RNA量大于5 μg,请按比例扩大反应体系。
i 逆转录操作步骤:
1.将RNA模板、引物、dNTP Mix、SuperRT Buffer、HiFi II M-MLV(H-)和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2.根据以下表格配制反应体系,总体积为20 μL。
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注意:若起始RNA的量小于50ng,则建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供。
3.涡旋震荡混匀,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。
4.55℃孵育1-30分钟,85℃孵育5分钟。反应结束后,短暂离心,置于冰上冷却。
5.逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应,或置于-20℃长期保存。
ii 若逆转录效率低,或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时,建议采用以下步骤:
1.将RNA模板、引物、dNTP Mix、SuperRT Buffer、HiFi II M-MLV(H-)和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2.根据以下表格配制反应体系,总体积为15 μL 。
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3. 70℃孵育10分钟,迅速冰浴2分钟。
4. 短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。
5. 向以上反应液中加入4 μL 5×SuperRT Buffer。
注意:若起始RNA的量小于50 ng,则建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供。
6. 轻轻吹打混匀,若反转录引物为Oligo-dT Primer或Specific Primer时,
7. 42℃孵育2 分 钟;若反转录引物为Random Primers,则25℃孵育10分钟。
8. 加入1 μL HiFi II M-MLV(H-) (200 U/μL),轻轻吸打混匀。 55℃孵育50分钟。 85℃孵育5分钟。反应结束后,短暂离心,置于冰上冷却。
9. 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应,或置于-20℃长期保存。
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