产品说明：

1：酵母杂交筛库后，需要对筛选平板的菌落进行鉴定，由于酵母菌细胞壁以及拷贝数的影响，常规的菌P方法成功率不稳定。

2：本产品在酵母质粒提取PE051，PE052 以及阳性克隆检测试剂盒SK2420的基础上，致力于解决酵母PCR成功率的问题，成功率可达100%，并免去玻璃珠震荡带来的人力损耗，一次可以处理192个样品，避免了摸索PCR条件带来的困扰。

3：一次提取实验，约耗时90-120min，可以得到192个样品的质粒DNA。所得产物可以满足PCR以及大肠杆菌转化实验。

4：本产品提供的酵母培养基为亮氨酸缺陷培养基，适用于pGADT7以及pGADT7-REC等leu筛选标记的质粒菌的扩繁。

实验准备：

1：产品储存：收到产品后，将96孔培养板（含SD-leu培养基）和提取液置于4℃冰箱；将酶解液置于-20℃冰箱；其他成分置于室温保存。

2：酵母菌扩繁：将96孔培养板（含SD-leu培养基）置于超净台中，将平板菌落分别接种于96孔中。盖好硅胶盖。于28-30℃培养至培养基变浑浊（OD值大于0.5，约需要培养12-24小时）。

提取步骤一（酶解）：

1.将酶解液置于37℃溶解（未用完的酶解液可以置于4℃保存一周，或者-20℃长期保存）。

2.离心沉淀96孔培养板培养所得酵母细胞（根据离心机转调整离心时间至酵母菌完全沉淀）。

3.在96孔培养板每孔加入200μL的酶解液重悬酵母菌沉淀，于37℃摇床（200-250rmp/min）孵育60min。

注意：30min时观察一下酵母菌是否沉淀，如沉淀震荡重悬。酶解时间可以延长（2-16h），不影响提取结果。

提取步骤二（裂解）：

1. 将提取液置于65℃水浴预热备用。

2. 酶解完成后，每孔酶解产物中加入600μL的提取液（此时酶解产物会变澄清，总体积为800μL）。

提取步骤三（纯化）：

1. 准备96孔质粒纯化板，置于96孔质粒回收板上（暂放，后续回收板用于质粒回收用）。

2. 将裂解产物（每孔800μL）加入吸附柱中，将96孔质粒纯化板转移到用过的96孔培养板上（用于废液回收），室温静置2min。

3. 将96孔质粒纯化板（套于96孔培养板中）用最高转速离心（例如4000rmp/min离心5min），弃穿透液。

4.将96孔质粒纯化板（套于96孔培养板中）每孔加入600μL洗涤液用最高转速离心（例如4000rmp/min离心5min），弃穿透液。

5.将96孔质粒纯化板（套于96孔培养板中）用最高转速离心（例如4000rmp/min离心5min），甩干残留液体。

提取步骤四（收集）：

1. 此时将洗脱液置于65-85℃水浴预热。

2. 将96孔质粒纯化板套于96孔质粒回收板上，每孔加入50μL的预热的洗脱液，室温静置3min。

3. 将96孔质粒纯化板（套于96孔质粒回收板中）用最高转速离心（例如4000rmp/min离心5min）。

4. 穿透液即为所得酵母质粒，取5μL用于50μL体系的PCR反应。取5-10μL用于大肠杆菌转化。