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ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-耐光型活性氧(ROS)检测试剂盒  ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-耐光型活性氧(ROS)检测试剂盒

登录可见价格

货号R253-100tests

品牌日本同仁化学/DOJINDO

品牌类型自有品牌(制造商)

货期现货

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北仁化学科技(北京)有限公司

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品牌 日本同仁化学/DOJINDO
基础属性 生产企业 日本同仁化学/DOJINDO
cas号
规格 100 tests
储存条件 0-5度保存
纯度
密度

产品解说

 

规格性状

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产品概述

ROS(Reactive Oxygen Species)主要是在线粒体中合成ATP时所产生的高活性氧簇。适量的ROS对细胞内的信号传导以及免疫机能都有促进作用,而过量的ROS对DNA和蛋白质所造成的氧化作用是导致多种疾病和细胞衰老的原因之一。

常见的细胞内ROS检测方法是利用DCFH-DA进入细胞内被ROS氧化后会发出荧光的特性进行检测。然而,DCFH-DA有灵敏度较低、染色后易从细胞内漏出、观察光所引起的自发荧光1)等问题。

    ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-克服了上述问题, 是一种比DCFH-DA灵敏度更高、进入细胞后可以与蛋白质结合抑制向细胞外漏出的荧光探针。更重要的是,它可以抑制由观察光所引起的自发荧光,可以更准确的反映细胞内ROS水平。另外,使用试剂盒内附带的Buffer进行观察,可以在尽量不伤害细胞的状态下检测细胞内的ROS。

1) M. Afzal, et al., "Method to overcome photoreaction, a serious drawback to the use of dichlorofluorescin in evaluation of reactive oxygen species" BBRC, 2003, 304, 619–624.

常见问题

相同实验条件下,检测结果的重现性差、由观察光引起荧光探针自发荧光的假阳性等问题是ROS检测的常见问题。而本试剂盒可以有效地解决上述问题。

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选择性对比

        Photo-oxidation Resistant DCFH-DA对各种活性氧(ROS)的选择性与DCFH-DA的选择性基本相同。另外,由于荧光特性(λex:505 nm; λem:525 nm)也相同,可以使用DCFH-DA相同的检测波长或Filter。

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性能比较表

同仁化学研究所的ROS荧光探针与市面上常见的ROS荧光探针的性能比较。

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关联产品ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-试剂  

抑制观察光造成的自发氧化

在未经任何刺激的正常HeLa细胞中,使用Photo-oxidation Resistant DCFH-DA染色细胞后,每5分钟观察一次细胞。结果显示,与一般的DCFH-DA相比,Photo-oxidation Resistant DCFH-DA可以明显的抑制观察光所引起的荧光探针的自氧化(假阳性)。

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<检测条件>
 GFP Filter: Ex = 450 - 490 nm, Em = 500 - 550 nm
 细胞系:HeLa细胞

染色后的细胞固定

    一般的荧光探针在细胞固定后容易泄漏到细胞外造成荧光强度降低,而用本试剂盒染色HeLa细胞并加入过氧化氢后,用PFA进行细胞固定,然后通过荧光观察发现固定后的荧光强度几乎没有变化,而且染料基本都滞留在细胞内。

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检测灵敏度的比较

利用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型,比较Photo-oxidation Resistant DCFH-DA与一般的DCFH-DA检测ROS的区别。从实验结果可以看出,同仁化学研究所的探针的灵敏度更高。

① 荧光显微镜检测

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<检测条件>

GFP Filter: Ex = 450 - 490 nm, Em = 500 - 550 nm)

② 荧光酶标仪检测

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<检测条件>

Ex = 490 - 520 nm, Em = 510 - 540 nm

③ 流式细胞仪检测

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<检测条件>

Ex = 488 nm, Em = 515 - 545 nm)

检测例

 

LPS诱导后,细胞内ROS水平的监测

用ROS Assay Kit –Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-染色RAW264.7细胞后,加入脂多糖(LPS)刺激细胞并开始实时监测细胞内的ROS水平。通过对检测结果的数值化分析可以看出,在LPS诱导10小时后,胞内的ROS水平明显开始升高。

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<检测条件>

细胞内ROS Photo-oxidation Resistant DCFH-DA Dye)

GFP Filter (Ex = 450 - 490 nm, Em = 500 - 550 nm)

 

<实验步骤>

1. 将RAW264.7细胞(2×105 cells/ml, DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)接种于黑色96-well孔板中。

2. 37℃、5% CO2培养箱过夜培养。

3. 去除培养基,用HBSS清洗细胞2次,添加Photo-oxidation Resistant DCFH-DA Dye Working solution。

4. 37℃、5% CO2培养箱内培养30 min。

5. 去除培养基,用HBSS清洗细胞2次,添加Highly Sensitive DCFH-DA Dye Working solution。

6. 37℃、5% CO2培养箱内培养30 min。

7. 去除培养基,用HBSS清洗细胞2次。添加含有500 ng/ml LPS的DMEM培养基,用荧光显微镜观察。

8. 每隔1小时检测荧光强度并绘制荧光强度/时间的曲线图。

与线粒体标记物Tom 20的共染色

使用本试剂盒染色HeLa细胞后加入过氧化氢,与Tom 20抗体进行免疫共染色,实现了胞内ROS水平与线粒体的形态的同时观察。该实验证明了本试剂盒可以完美解决传统ROS荧光探针无法用于免疫荧光染色的问题。

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<检测条件>

激光共聚焦显微镜

(蓝) DAPI: Ex = 405 nm, Em = 450-495 nm

(绿) Photo-oxidation Resistant DCFH-DA: Ex = 488 nm, Em = 500-550 nm

(紫) Alexa Fluor 647: Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm

Scale bar:10 µm

FAQ

Q:每个试剂盒可以检测多少个样品?
A:可检测的样品数请参考下列信息:

 

・ 96-well plate:1块板
・ ibidi 8-well plate:6块板
・ 35 mm dish:5块
・ 6-well plate:5个孔

Q:是否有可作为“阳性对照”的实验例?

A:产品的使用说明书中的“实验例2”有过氧化氢刺激HeLa的检测实例。请参考说明书实验例2的步骤1-5。

Q:是否可以使用Loading buffer以外的缓冲液来配制Working solution?

A:为了减小观测时对细胞的损伤,建议尽量使用Loading buffer来配制。另外,也可以使用 Hanks’ HEPES或HBSS来配制。如果需要用培养基配制,请使用无血清培养基。

Q:清洗细胞时,是否可以用PBS替代HBSS?

A:为了减小对细胞的损伤,建议尽量使用HBSS。如果手头没有HBSS,建议用培养基清洗细胞。

Q:在使用流式细胞仪检测时,建议在哪一步将贴壁细胞剥落?

A:参照使用说明书,建议在步骤6(药物刺激后并用HBSS清洗细胞之后),将细胞剥离(胰酶消化)。胰酶消化后重新加入培养基,离心后用HBSS清洗1次,再次离心去上清之后,用HBSS重悬细胞用于检测

 

商品详情 (dojindo.cn)

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