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货号R253-100tests
品牌日本同仁化学/DOJINDO
品牌类型自有品牌（制造商）
货期现货
-+
| 品牌 | 日本同仁化学/DOJINDO | |
| 基础属性 | 生产企业 | 日本同仁化学/DOJINDO |
| cas号 | ||
| 规格 | 100 tests | |
| 储存条件 | 0-5度保存 | |
| 纯度 | ||
| 密度 |
产品解说
规格性状
产品概述
ROS（Reactive Oxygen Species）主要是在线粒体中合成ATP时所产生的高活性氧簇。适量的ROS对细胞内的信号传导以及免疫机能都有促进作用，而过量的ROS对DNA和蛋白质所造成的氧化作用是导致多种疾病和细胞衰老的原因之一。
常见的细胞内ROS检测方法是利用DCFH-DA进入细胞内被ROS氧化后会发出荧光的特性进行检测。然而，DCFH-DA有灵敏度较低、染色后易从细胞内漏出、观察光所引起的自发荧光1)等问题。
ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-克服了上述问题， 是一种比DCFH-DA灵敏度更高、进入细胞后可以与蛋白质结合抑制向细胞外漏出的荧光探针。更重要的是，它可以抑制由观察光所引起的自发荧光，可以更准确的反映细胞内ROS水平。另外，使用试剂盒内附带的Buffer进行观察，可以在尽量不伤害细胞的状态下检测细胞内的ROS。
1) M. Afzal, et al., "Method to overcome photoreaction, a serious drawback to the use of dichlorofluorescin in evaluation of reactive oxygen species" BBRC, 2003, 304, 619–624.
常见问题
相同实验条件下，检测结果的重现性差、由观察光引起荧光探针自发荧光的假阳性等问题是ROS检测的常见问题。而本试剂盒可以有效地解决上述问题。
选择性对比
Photo-oxidation Resistant DCFH-DA对各种活性氧(ROS)的选择性与DCFH-DA的选择性基本相同。另外，由于荧光特性（λex：505 nm; λem：525 nm）也相同，可以使用DCFH-DA相同的检测波长或Filter。
性能比较表
同仁化学研究所的ROS荧光探针与市面上常见的ROS荧光探针的性能比较。
关联产品：ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-试剂 ←
抑制观察光造成的自发氧化
在未经任何刺激的正常HeLa细胞中，使用Photo-oxidation Resistant DCFH-DA染色细胞后，每5分钟观察一次细胞。结果显示，与一般的DCFH-DA相比，Photo-oxidation Resistant DCFH-DA可以明显的抑制观察光所引起的荧光探针的自氧化(假阳性)。
<检测条件>
GFP Filter: Ex = 450 - 490 nm, Em = 500 - 550 nm
细胞系：HeLa细胞
染色后的细胞固定
一般的荧光探针在细胞固定后容易泄漏到细胞外造成荧光强度降低，而用本试剂盒染色HeLa细胞并加入过氧化氢后，用PFA进行细胞固定，然后通过荧光观察发现固定后的荧光强度几乎没有变化，而且染料基本都滞留在细胞内。
检测灵敏度的比较
利用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型，比较Photo-oxidation Resistant DCFH-DA与一般的DCFH-DA检测ROS的区别。从实验结果可以看出，同仁化学研究所的探针的灵敏度更高。
① 荧光显微镜检测
<检测条件>
GFP Filter: Ex = 450 - 490 nm, Em = 500 - 550 nm)
② 荧光酶标仪检测
<检测条件>
Ex = 490 - 520 nm, Em = 510 - 540 nm
③ 流式细胞仪检测
<检测条件>
Ex = 488 nm, Em = 515 - 545 nm)
检测例
LPS诱导后，细胞内ROS水平的监测
用ROS Assay Kit –Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-染色RAW264.7细胞后，加入脂多糖(LPS)刺激细胞并开始实时监测细胞内的ROS水平。通过对检测结果的数值化分析可以看出，在LPS诱导10小时后，胞内的ROS水平明显开始升高。
<检测条件>
细胞内ROS Photo-oxidation Resistant DCFH-DA Dye）
GFP Filter (Ex = 450 - 490 nm, Em = 500 - 550 nm)
<实验步骤>
1. 将RAW264.7细胞(2×105 cells/ml, DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)接种于黑色96-well孔板中。
2. 37℃、5% CO2培养箱过夜培养。
3. 去除培养基，用HBSS清洗细胞2次，添加Photo-oxidation Resistant DCFH-DA Dye Working solution。
4. 37℃、5% CO2培养箱内培养30 min。
5. 去除培养基，用HBSS清洗细胞2次，添加Highly Sensitive DCFH-DA Dye Working solution。
6. 37℃、5% CO2培养箱内培养30 min。
7. 去除培养基，用HBSS清洗细胞2次。添加含有500 ng/ml LPS的DMEM培养基，用荧光显微镜观察。
8. 每隔1小时检测荧光强度并绘制荧光强度/时间的曲线图。
与线粒体标记物Tom 20的共染色
使用本试剂盒染色HeLa细胞后加入过氧化氢，与Tom 20抗体进行免疫共染色，实现了胞内ROS水平与线粒体的形态的同时观察。该实验证明了本试剂盒可以完美解决传统ROS荧光探针无法用于免疫荧光染色的问题。
<检测条件>
激光共聚焦显微镜
(蓝) DAPI: Ex = 405 nm, Em = 450-495 nm
(绿) Photo-oxidation Resistant DCFH-DA: Ex = 488 nm, Em = 500-550 nm
(紫) Alexa Fluor 647: Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm
Scale bar：10 µｍ
FAQ
| Q：每个试剂盒可以检测多少个样品？ |
| A：可检测的样品数请参考下列信息：
・ 96-well plate：1块板 |
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Q：是否有可作为“阳性对照”的实验例？ |
| A：产品的使用说明书中的“实验例2”有过氧化氢刺激HeLa的检测实例。请参考说明书实验例2的步骤1-5。 |
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Q：是否可以使用Loading buffer以外的缓冲液来配制Working solution？ |
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A：为了减小观测时对细胞的损伤，建议尽量使用Loading buffer来配制。另外，也可以使用 Hanks’ HEPES或HBSS来配制。如果需要用培养基配制，请使用无血清培养基。 |
| Q：清洗细胞时，是否可以用PBS替代HBSS？ |
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A：为了减小对细胞的损伤，建议尽量使用HBSS。如果手头没有HBSS，建议用培养基清洗细胞。 |
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Q：在使用流式细胞仪检测时，建议在哪一步将贴壁细胞剥落？ |
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A：参照使用说明书，建议在步骤6(药物刺激后并用HBSS清洗细胞之后)，将细胞剥离(胰酶消化)。胰酶消化后重新加入培养基，离心后用HBSS清洗1次，再次离心去上清之后，用HBSS重悬细胞用于检测 |
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