Fdneurotech PK401快速高尔基染色试剂盒

高尔基染色法是研究正常或异常状态下神经元及胶质细胞的zui有效的技术^{2, 5}，利用高尔基染色技术可以检测到药物处理的动物脑切片或神经系统疾病死亡患者脑切片上神经树突/树突棘的细微改变^{1, 3}。然而常规高尔基染色技术的可重复性及过程费时极大的阻碍了该技术的广泛应用。根据Ramón-Moliner⁵， Glaser 与 Van der Loos⁴发表的研究方法及原理，本公司开发出了FD快速高尔基染色试剂盒（FD Rapid GolgiStain™ kit）。该试剂盒不仅极大的改进和简化了常规高尔基染色法，而且在神经元和胶质细胞的形态细节（特别是树突棘）的检测上更为可靠和灵敏。本试剂盒有效性已在多种动物脑片及人类尸检脑片上得到详细验证。

II. 试剂盒内容物（室温保存）

                          型号

PK401A      PK401

溶液A             125 ml        250 ml

溶液B             125 ml        250 ml

溶液C            125 ml x 2     250 ml x 2

溶液D             125 ml        250 ml

溶液E             125 ml        250 ml

玻璃取片器          2            2

毛刷                2            2

滴瓶                1            1

塑料夹              1            1

说明书              1            1

III. 需自备材料及试剂

1. 双蒸水或Milli-Q水

2. 塑料/玻璃瓶或管，

3. 病理染色设备，明胶包被的载玻璃片 (Cat. #PO101)，盖玻片，染色缸，乙醇，二甲苯，封片剂，显微镜

IV. 操作注意事项

1. 本试剂盒仅仅用于体外研究，不得用于药物、诊断等其它用途。

2. 本试剂盒内试剂皮肤接触时为有毒有害，误服有致命危险，取用时用电动移液器或洗耳球吸取（不得用嘴吸取），并避免吸入或接触皮肤、眼睛。如有接触需立即用大量水冲洗并及时就医。加入误服，应吐出并用大量水漱口，并立即就医。

3. 在通风橱内操作，穿戴防护服，手套，护眼眼睛。每次实验结束后彻底清洗手部。

V. 组织准备

一、实验准备：（使用本试剂盒前请仔细阅读该部分）

所有容器（尽量使用塑料材质）须洗净并用双蒸水冲洗。

在操作溶液A及溶液B是避免使用金属容器。

使用过程中保持容器密闭。

使用溶液A与溶液B进行处理（包括处理切片）时尽量保持避光。·

二、操作步骤：（以下步骤除明确要求外均在室温下进行）

1. 实验动物须深度麻醉后处死，脑组织（或人尸体脑组织）应尽快并小心取出，避免损伤或压迫组织。

注意：除必要的情况下动物无需灌注，如确实需要以4%多聚甲醛灌注动物，应少于5分钟，并不用后固定。

大的脑组织（包括大鼠脑）应以锋利小刀切割成约10mm厚的小块（重要）。

2. 双蒸水或Milli-Q 水冲洗组织以除去表面血液。

3. 将组织浸入等体积的溶液A和溶液B混合而成的浸泡液中，室温避光保存约2周，在浸入6小时或第二天更换浸泡溶液。通常2周的浸泡时间可以获得满意的实验结果，但是不同大小及类型的组织需要的浸泡时间可能不同，因此，为获得zui佳的实验结果，每种类型的组织在相同大小下仍需要预实验以确定zui佳浸泡时间，一般而言3周的浸泡时间对大多数组织均足够。需要注意的是，浸泡时间越长，背景染色越深。

注意事项：浸泡液需要在使用前24小时配置，并保持静止，使用无沉淀的上清作为浸泡液。配置好的浸泡液可以在室温下避光保存一个月。每一立方厘米至少使用5 ml浸泡液，浸泡液过少可减少染色敏感性及可靠性。同时，为获得zui佳染色效果，每周应轻柔旋转摇动浸有组织块的容器两次（切忌剧烈摇动），每次几秒即可。

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i 警告:

溶液A及溶液B因含有有毒的氯化银，重铬酸钾及铬酸钾，避免接触皮肤，误服可能致死。实验应在化学通风橱或安全柜里进行，并穿戴适当的保护服，手套及眼/脸保护设备。用完的溶液不得倒入下水道，应装入的容器内，通知有害试剂回收部门进行处理。

4. 将浸泡后的组织转入溶液C，室温避光保存72小时（zui多一周）。浸泡24小时后换液一次。

5. 在冰冻切片机上调整切片箱温度（-20°C 到 -22°C）将组织片切成100到200 μm 切片（切片前请仔细阅读本条下的注意事项）。除冰冻切片机外，其它如滑动式切片机或振动切片机等也可以使用（细节请看本条下注意事项）。然后用本试剂盒提供玻璃取片器将切片转移至滴有溶液C的明胶包被载波片上(Cat. #PO101) ，为便于在载波片上滴加溶液C，本试剂盒提供了一只滴瓶。载波片上多余的溶液应以巴斯德管吸除，然后用吸水纸尽可能吸净，或者可导致脱片。然后将切片自然风干（切忌热风吹干或烤干）。为尽可能获得好的染色结果，切片应尽快进行染色，如确需保存，可在室温避光条件下保存zui多3天。

注意事项：

（1）、切片准备：为避免组织冰冻是受到损坏，尽可能好的保持组织细胞形态，样品应在冰冻切片机上进心速冻。例如：样品可以如下方式进行速冻：将样品放在塑料勺中，缓慢浸入以干冰预冷的异戊烷（为获得zui佳结果，预冷的异戊烷应低于零下70度，在1分钟内浸入，越慢越好），在组织完全浸入异戊烷后，等待几秒然后捞至干冰上放置一分钟，以确保样品达到zui佳速冻状态。在切片前切忌速冻好的样品解冻。

（2）切片机选择：能切出较厚切片的切片机均可选择（如100um）。如冰冻切片机只有一个温度控制，请在切片前设置切片箱温度至-22度至少4小时。如切片机有两个温度设置程序，请设置切片箱温度低于刀头温度1度。需要注意的是，-22度多数情况下可以获得满意的染色结果，然而不同的切片机与不同样品可能需要高一些或低一些的切片温度以保证切片的平滑与完整。

（3）以下内容有助于冰冻切片机操作：1）使用双蒸水将样品装到样品盘上，并确保样品未融化（可以在干冰上操作）。也可以用其它样品凝固剂进行安装（如OCT）但是不要将样品完全包在凝固剂上，避免切片时刀片切到凝固剂。如果样品必须包埋后才能切片，请使用TFM（TBS, Durham, NC, USA, Cat. #TFM-5）包埋。2）样品装上样品盘后，干冰上放置10分钟，然后立即将装上样品的样品盘安装到冰冻切片机上相应位置，在切片前任其放置5分钟。3）先试切几片（勿使用防卷板），如样品过冷（可能表现为与刀片平行的切片易碎），那么请等待几分钟再切，如切片符合要求，则可继续切片。

· 灌注的脑组织也可以用琼脂糖或白明胶包埋，然后用振动切片机进行切片，但是必须使用溶液C收集切片（切片机孵育槽里须注满溶液C）。否则切片在干燥时可能碎裂。如用滑动切片机切灌注的脑组织，刀台和刀片均需要维持在低温（低于零度），同样，切片必须覆盖在溶液C内。

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VI. 染色步骤：

1.双蒸水或Milli-Q水清洗切片两次，每次4分钟。

2. 将切片放入混有1份溶液D，一份溶液E及两份双蒸水或Milli-Q水的混合液中处理 10分钟。

如：溶液D10ml+溶液E10 ml+双蒸水或Milli-Q水20 ml

注意事项：混合工作液须现用现配，100ml混合工作液zui多处理100张小鼠脑片（根据切片大小确定）。染缸必须加盖以避免试剂蒸发，并不时旋转搅动孵育液。在整个染色过程中（封片前）均勿让切片啊干燥。

3. 双蒸水或Milli-Q水清洗切片两次，每次4分钟。(每次更换双蒸水).

4. 甲酚紫或硫堇衬染（可选步骤），如要进行衬染，步骤3中清洗时间和次数均要增加，如清洗4次，每次5分钟或更长时间。

5. 50%、75%、95% 乙醇梯度脱水, 每个梯度4分钟 (不可跳过某个浓度).

6. 无水乙醇脱水4次，每次4分钟（不可增加时间）

7. 二甲苯透明3次，每次4分钟，用Permount®封片。

注意事项：封片前切片可在二甲苯中存放几小时，为获得zui佳染色效果，请使用纯的未稀释的Permount®封片。染色好的切片应随时避光。